BLI ali SPR: Izbira idealne metode za analizo biomolekularnih interakcij

Razumevanje kinetike vezave med molekulami ali merjenje koncentracije aktivnih analizatorjev sta temeljni metodi karakterizacije, tako v osnovnih raziskavah kot pri odkrivanju zdravil. V nasprotju z metodo končnega punkta, kot je ELISA, metode v realnem času brez oznak za analizo biomolekularnih interakcij ne zahtevajo označevanja nobenega interaktanta, kar omogoča oblikovanje preprostejših testov. Pomanjkanje fluorescentnih oznak in/ali sekundarnih reagentov za detekcijo prav tako odpravlja motnje ali povezane eksperimentalne artefakte, kar pušča čiste podatke, ki bolje zajamejo biološko relevantne interakcije.

Bioslojna interferometrija (BLI) in površinska plazmonska resonanca (SPR) nudita podatke v realnem času in sta dragoceni za razumevanje biomolekularnih mehanizmov, saj omogočata vpogled v kinetiko, afiniteto in specifičnost interakcij. Izbira med BLI in SPR je odvisna od specifičnih zahtev študije, kot so občutljivost, prepustnost in vrsta vzorca.

BLI deluje brez fluidike, saj uporablja interferenco svetlobe za odkrivanje molekularne vezave, kar ga naredi primernega za neprečiščene biološke vzorce in visoko prepustni presejanje. Ker ni potrebno imeti prečiščenega biološkega vzorca, temveč se lahko uporabljajo celični lizati, zagotavlja merjenje interakcij v nativnih pogojih.

SPR odkriva spremembe mase, povezane z lomnim indeksom, kar nudi visoko občutljivost za interakcije beljakovin in aktivnih snovi zdravil v prečiščenih vzorcih.

Bioslojna interferometrija (BLI)

Bioslojna interferometrija je analitična tehnika, ki spremlja interferenčni vzorec bele svetlobe, ki se odraža od dveh površin — prva površina je plast imobiliziranega proteina na vrhu biosenzorja, druga pa notranja referenčna plast.

BLI tehnologija deluje tako, da se biosenzor premakne do plošče z 96 ali 384 jamicami in "potopi" v vzorec (angleško "dip-and-read"), kar predstavlja robusten in enostaven način vnosa analita na površino senzorja. Ko se analit veže na imobilizirani ligand, BLI z meritvijo interferenčnih sprememb med svetlobnimi valovi, oziroma valovnimi dolžinami, zazna spremembo debeline biosloja na vrhu biosenzorja.

Octet^® BLI omogočajo analizo biomolekularnih interakcij v realnem času, brez označevanja analitov — za določanje kinetike, afinitete in kvantifikacijo protiteles/proteinov z neprimerljivo prihranko časa in stroškov. Področja uporabe Octet^® BLI vključujejo:

• kinetika vezave — interakcije protein-protein, karakterizacija protiteles, vezava protitelo-antigen, DNA-aptameri, delci-protitelo, interakcije bakterija-protitelo in druge
• kvantifikacija protiteles — kvantitativno določanje proteinov, AAV titar, odzivi protiteles na cepljenje, testi potence, imunogenost, odkrivanje kontaminacije ter profiliranje glikozilacije
• presejanje — presejanje vezav, DNA-aptamerov in inhibitorjev, izbira klonov
• razvoj testa — razvoj formulacije, razvoj medijev, razvoj in optimizacija celične linije, validacija testov

Prihranek časa in stroškov z Octet® BLI tehnologijo:

• večja prepustnost omogoča kvantifikacijo proteinov v samo dveh minutah in hkraten obdelavo do 96 vzorcev
• avtomatizirana analiza za hitrejše rezultate in hitrejše lansiranje na trg
• analiza molekularnih interakcij v realnem času
• merjenje analitov v neprečiščenih vzorcih, kot so celične kulture, lizati ali supernatanti
• enostavnost uporabe na integriranem uporabniškem vmesniku, zasnovanem za biologe
• sistem brez tekočin olajša neposredno analizo v zgodnjih fazah raziskav in je enostaven za vzdrževanje

Površinska plazmonska resonanca (SPR)

Zgodnja identifikacija kinetike, afinitete in konkurenčnih lastnosti spojine je ključna za sprejemanje pravih odločitev v začetnih fazah procesa odkrivanja zdravila. Površinska plazmonska resonanca (SPR) je analitična metoda za merjenje molekularnih interakcij v realnem času.

SPR tehnologija uporablja sistem neprekinjenega pretoka za dovajanje analita do imobiliziranega liganda na biosenzorskem čipu. Molekularno vezanje analita na ligand povzroči spremembo mase in spremembo lomnega količnika na površini senzorja, kar povzroči premik refleksnega indeksa na površini senzorja, kar je vidno na senzogramu.

Naprava Octet^® SPR vsebuje biosenzor in čipe, ki jih sestavlja tanko stekelce, prevlečeno s tankim, polprozornim zlatim filmom, ki omogoča refleksijo svetlobe in pod določenim kotom generira površinski plazmonski val na vmesniku med vzorcem in zlato površino. Spremembe v lomnem količniku omogočajo zaznavanje molekularnih interakcij. SPR testi pogosto vključujejo pretočni sistem fluidike za dostavo analitov na površino biosenzorja. Tipični testi vezave, bodisi na osnovi ravnotežja ali kinetike, zahtevajo titracijo več koncentracij analita za natančno določitev kinetičnih in afinitetnih konstant. Medtem ko tradicionalne SPR platforme za vezavo uporabljajo injekcije fiksnih koncentracij (FCI) za dostavo vzorcev, Sartorius Octet^® SF3 SPR platforma ponuja "Next generation" tehnologijo prek OneStep^® in NeXtStep™ injekcij.

Natančna in hitra biološka odkritja s tehnologijo Octet® SPR:

• vrhunske gradientne injekcije za natančno merjenje in oceno kinetike molekul ter afinitete iz ene koncentracije analita v enem samem testu
• uporaba dveh puferjev med eno analizo
• optimiziran fluidni sistem zmanjšuje potencialne vire zamašitve in vključuje učinkovite protokole dekontaminacije
• vbrizgavanje vzorca za obnovitev vezanega analita omogoča prihranek dragocenega analita
• nadzor temperature omogoča oceno kinetike in afinitete terapevtikov pri fizioloških temperaturah

Zbiranje vzorcev z visoko prepustnostjo

• generiranje celotne kinetike in afinitete do 768 vzorcev v enem samem testu
• tehnologija OneStep^® Injection: več kot 72 ur neprekinjenega delovanja brez nadzora in edinstvena razporeditev vzorcev omogoča visokoprepustno zbiranje in analizo stotin vzorcev v enem ciklu.

OneStep® tehnologija vbrizgavanja

• prihrani čas, reagente in prostor na plošči ter zmanjša potencialne napake pri razvoju testa
• omogoča natančno merjenje kinetike vezave in afinitete iz posamezne koncentracije analita

NeXtStep™ gradientne injekcije

• natančni kompetitivni testi omogočajo preučevanje obnašanja analita in prisotnosti konkurenčne molekule iz ene same injekcije
• ocena več analitov in konkurentov v enem testu, brez potrebe, da je konkurent prisoten v tekočem puferju.

• Povezana vsebina: Kakšne spremembe prinaša novi EU GMP Annex 1 za mikrobiološko spremljanje zraka v čistih prostorih?

Izbira ene tehnike ali sinergija metod: Doseganje optimalnih rezultatov

Izbira med BLI in SPR tehniko je odvisna od uporabe in razpona velikosti vključenih molekul. SPR je na primer bolj občutljiva tehnika za merjenje interakcij z majhnimi molekulami in fragmenti. Po drugi strani je BLI primernejša za izrazito produktivno analizo v farmacevtski industriji, z dodatno prilagodljivostjo za izvajanje testov v neprečiščenih bioloških vzorcih, kot so celični lizati med optimizacijo procesov ali spremljanjem bioprocesov.

Komplementarni pristop

Ko se uporabljata skupaj, sta BLI in SPR močna dopolnilna orodja za karakterizacijo biomolekul, kot so protitelesa, fragmenti ali drugi bioterapevtski proteini v raziskovalnih in delovnih tokovih analiz. Ta ortogonalni, dopolnilni pristop je še posebej koristen za delovne procese, ki vključujejo začetni presejalni postopek, kot je neposreden presejalni postopek supernatanatov ali prikaz fagov pri razvoju protiteles. Skupaj te tehnike povečujejo robustnost študij biomolekularnih interakcij, optimizirajo uporabo virov ter prihranijo čas in stroške.

Zaključno, tako BLI kot SPR omogočata analizo molekularnih interakcij v realnem času, kar pomaga pri razumevanju mehanizma vezanja. Izbira prave platforme je odvisna od ciljev analize, vrst vzorcev in drugih specifičnih laboratorijskih dejavnikov. Vsaka tehnika ponuja edinstvene prednosti, ki zadovoljijo različne aspekte procesa odkrivanja zdravil.

V Kompendiju za uspešne BLI in SPR analize boste našli podrobna poglavja in strokovne nasvete o oblikovanju in izvajanju testov za merjenje kinetike biomolekularnih interakcij.

Članek je bil vzet in preveden z uradne strani Sartorius.

Za pomoč pri izbiri idealne metode za vaše raziskave nas kontaktirajte še danes!