BLI ili SPR: Odabir idealne metode za analizu biomolekularnih interakcija

Razumijevanje kinetike vezanja između molekula ili mjerenje koncentracije aktivnih analita temeljne su metode karakterizacije, kako u temeljnim istraživanjima, tako i u otkrivanju lijekova. Za razliku od metode krajnje točke kao što je ELISA, metode u stvarnom vremenu bez oznaka za analizu biomolekularnih interakcija ne zahtijevaju označavanje nijednog interaktanta, što omogućuje dizajniranje jednostavnijih testova. Nedostatak fluorescentnih oznaka i/ili sekundarnih reagensa za detekciju također eliminira smetnje ili povezane eksperimentalne artefakte, ostavljajući čiste podatke koji bolje bilježe biološki relevantne interakcije.

Bioslojna interferometrija (BLI) i površinska plazmonska rezonancija (SPR) nude podatke u stvarnom vremenu i vrijedne su za razumijevanje biomolekularnih mehanizama, pružajući uvid u kinetiku, afinitet i specifičnost interakcija. Izbor između BLI i SPR ovisi o specifičnim zahtjevima studije, poput osjetljivosti, protočnosti i vrste uzorka.

BLI radi bez fluidike, koristeći interferenciju svjetlosti za otkrivanje molekularnog vezanja, što ga čini prikladnim za nepročišćene biološke uzorke i visokoprotočni probir. Obzirom da nije potrebno imati pročišćeni biološki uzorak, već se mogu koristiti stanični lizati, osigurava se mjerenje interakcije u nativnim uvjetima.

SPR otkriva promjene mase povezane s indeksom loma, nudeći visoku osjetljivost za interakcije proteina i aktivnih tvari lijekova u pročišćenim uzorcima.

Što je Bioslojna interferometrija (BLI)?

Bioslojna interferometrija je analitička tehnika koja prati interferencijski uzorak bijele svjetlosti reflektirane od dvije površine - prva površina je sloj imobiliziranog proteina na vrhu biosenzora, a druga unutarnji referentni sloj.

BLI tehnologija djeluje na način da se biosenzor pomiče do pločice s 96 ili 384 jažice i "uranja" u uzorak (eng. dip-and-read), što predstavlja robustan i jednostavan način uvođenja analita na površinu senzora. Kada se analit veže za imobilizirani ligand, BLI bilježi promjenu debljine biosloja na vrhu biosenzora mjerenjem interferencije između svjetlosnih valova, odnosno valnih duljina.

Octet^® BLI analitički sustavi omogućuju analizu biomolekularnih interakcija u stvarnom vremenu, bez označavanja analita - za određivanje kinetike, afiniteta i kvantifikaciju antitijela/proteina uz neviđenu uštedu vremena i troškova. Područja primjene Octet^® BLI:

• kinetika povezivanja  - interakcija protein-protein, karakterizacija antitijela, vezivanje antitijelo-antigen, DNA-aptamera, čestica-antitijelo, interakcije bakterija-protutijelo i druge
• kvantifikacija antitijela - kvantitativno određivanje proteina, AAV titar, odgovori protutijela izazvani cjepivom, testovi potencije, imunogenost, otkrivanje kontaminacije te profiliranje glikozilacije
• probir - probir vezanja, DNA-aptamera i inhibitora, izbor klona
• razvoj testa - razvoj formulacije, razvoj medija, razvoj i optimizacija stanične linije, validacije testova

Ušteda vremena i troškova uz Octet® BLI tehnologiju:

• veća propusnost omogućuje kvantifikaciju proteina u samo dvije minute i paralelnu obradu do 96 uzoraka
• automatizirana analiza za brže rezultate i lansiranje na tržište
• analiza molekularnih interakcija u stvarnom vremenu
• mjerenje analita u nepročišćenim uzorcima, poput staničnih kultura, lizata ili supernatanata
• jednostavnost korištenja na integriranom korisničkom sučelju dizajniranom za biologe
• sustav bez fluida olakšava izravnu analizu u ranim fazama istraživanja, te je nezahtjevan za održavanje

Što je Površinska plazmonska rezonancija (SPR)?

Rana identifikacija kinetike, afiniteta i konkurentskih svojstava spoja presudna je za donošenje ispravnih odluka u početnim fazama procesa otkrivanja lijeka. Površinska plazmonska rezonancija je analitička metoda za mjerenje molekularnih interakcija u stvarnom vremenu.

SPR tehnologija koristi sustav kontinuiranog protoka za isporuku analita do imobiliziranog liganda na biosenzorskom čipu. Molekularno vezanje analita za ligand uzrokuje promjenu mase i promjenu indeksa loma na površini senzora, što rezultira pomakom reflektivnog indeksa na površini senzora, što se može vidjeti na senzogramu.

Uređaj Octet^® SPR sadrži biosenzor, čipove koje čini tanko predmetno stakalce presvučeno tankim, poluprozirnim zlatnim filmom, koji omogućuje refleksiju svjetlosti te pod određenim kutem generira površinski plazmonski val na sučelju između uzorka i zlatne površine. Promjene u indeksu loma omogućuju detekciju molekularnih interakcija. SPR testovi često uključuju sustav fluidike temeljen na protoku za dostavu analita na površinu biosenzora. Tipični testovi vezanja, bilo da se temelje na ravnoteži ili kinetici, zahtijevaju titraciju više koncentracija analita kako bi se točno utvrdile kinetičke i afinitetne konstante.

Dok tradicionalne SPR platforme za vezanje koriste injekcije fiksnih koncentracija (FCI) za isporuku uzoraka, Sartorius Octet^® SF3 SPR platforma nudi „Next generation“ tehnologiju putem OneStep^® i NeXtStep™ injekcija.

Točna i brza biološka otkrića Octet® SPR tehnologije:

• vrhunske gradijentne injekcije za precizno mjerenje i procjenu kinetike molekula i afiniteta iz jedne koncentracije analita u pojedinačnom testu
• korištenje dva pufera tijekom jedne analize
• optimizirani fluidni sustav minimalizira potencijalne izvore začepljenja uz učinkovite protokole dekontaminacije
• ubrizgavanje uzorka za oporavak vezanog analita omogućuje uštedu dragocjenog analita
• kontrola temperature omogućuje procjenu kinetike i afiniteta terapeutika na fiziološkim temperaturama

Prikupljanje uzoraka visoke propusnosti

• generiranje kompletne kinetike i afiniteta do 768 uzoraka u jednom testu
• tehnologija OneStep^® Injection: više od 72 sata rada bez nadzora i jedinstveni raspored uzoraka omogućuje visokopropusno prikupljanje i analizu stotina uzoraka u jednom ciklusu

OneStep® tehnologija ubrizgavanja

• štedi vrijeme, reagense i prostor na ploči te smanjuje potencijalne pogreške u razvoju testa
• omogućuje precizno mjerenje kinetike vezanja i afiniteta iz pojedinačne koncentracije analita

NeXtStep™ gradijentne injekcije

• precizni kompetitivni testovi omogućuju ispitivanje ponašanja analita i prisutnosti konkurentske molekule iz jedne injekcije
• procjena višestrukih analita i konkurenata u jednom testu, bez potrebe da konkurent bude prisutan u tekućem puferu

• Povezani sadržaj: Koje promjene donosi novi EU GMP Annex 1 za mikrobiološko praćenje zraka u čistim prostorijama?

Odabir jedne tehnike ili sinergija metoda: Postizanje optimalnih rezultata

Odabir između BLI i SPR tehnike ovisi o primjeni i rasponu veličina uključenih molekula. SPR je, na primjer, osjetljivija tehnika za mjerenje interakcija s malim molekulama i fragmentima. S druge strane, BLI je prikladniji za izrazito produktivnu analizu u pharma-industriji, uz dodatnu fleksibilnost za izvođenje testova u nepročišećim biološkim uzorcima, odnosno staničnim lizatima tijekom optimizacije procesa ili praćenja bioprocesa.

Komplementarni pristup

Kada se koriste paralelno, BLI i SPR su moćan komplementarni alat za karakterizaciju biomolekula, kao što su antitijela, fragmenti ili drugi bioterapijski proteini u istraživačkim i radnim tokovima analiza. Ovaj ortogonalan, komplementarni pristup posebno je koristan za radne procese koji uključuju početni probir, kao što je izravni probir supernatanata ili prikaz faga u razvoju antitijela. Zajedno, ove tehnike povećavaju robusnost studija biomolekularnih interakcija, optimizirajući korištenje resursa te štedeći vrijeme i troškove.

Zaključno, i BLI i SPR pružaju analizu molekularnih interakcija u stvarnom vremenu, pomažući razumijevanju mehanizma vezanja. Odabir prave platforme ovisi o ciljevima analize, vrstama uzoraka i drugim specifičnim laboratorijskim faktorima. Svaka tehnika nudi jedinstvene prednosti koje zadovoljavaju različite aspekte procesa otkrivanja lijekova.

Ovaj članak je preuzet i preveden sa službene Sartorius stranice.

U Kompendiju za uspješne BLI i SPR analize pronađite detaljna poglavlja i stručne savjete o dizajniranju i provođenju testova mjerenje kinetike biomolekularnih interakcija.

Za pomoć pri odabiru idealne metode za vaše istraživanje, obratite nam se danas!